詳述Pcr儀的四大分類及常見問題解答

詳述Pcr儀的4大分類及常見問題解答
PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專1性的連鎖復制。目前經常使用的技術，可以將1段基因復制為原來的1百億至1千億倍。根據DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀4類。
普通PCR儀
1般把1次PCR擴增只能運行1個特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要屢次運行。主要是用作簡單的，對目的基因退火溫度的擴增。
主要利用于科研、教學、臨床醫學、檢驗、檢疫等。
梯度PCR儀
1次性PCR擴增可以設置1系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）的稱之為梯度PCR儀。由于被擴增的不同的DNA片斷其合適的退火溫度不同，通過設置1系列的梯度退火溫度進行擴增，從而1次性PCR擴增就能夠挑選出表達量高的合適退火溫度進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣既節儉時間，也節儉經費。在不設置梯度的情況下亦可當作普通的PCR用。正真的梯度，是每排管都有精確的加熱控溫探頭，2009年為止只有美國ABI公司可以做到。其他的都是從兩頭的熱傳遞來設計控溫。
梯度PCR儀多利用于科研、教學機構。
原位PCR儀
（有些品牌的PCR儀具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通過替換模塊進行多用處展開實驗工作）
是用于從細胞內靶DNA的定位分析的細胞內基因擴增儀。如病原基因在細胞的位置或目的基因在細胞內的作用鑄造試驗儀器位置等。可保持細胞或組織的完全性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置進行基因擴增。不但可以檢測到靶DNA，還能標出靶序列在細胞內的位置。于份子和細胞水平上研究疾病的病發機理和臨床進程及病理的轉變有側重大的實用價值。
實時熒光定量PCR儀
在普通PCR儀設計基礎上增加熒光信號激起和收集系統和計算機分析處理系統，構成了具有熒光定量PCR功能的儀器。其PCR擴增原理和普通PCR擴增原理相同，在PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號收集系統實時收集信號連接輸送到計算機分析處理系統，得出量化的實時結果輸出。
熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當只用1種熒光探針標記的時候，選用單通道；有多種熒光標記的時候使用多通道。單通道也能夠檢測多熒光的標記和目的基因表達產物，由于1次只能檢測1種目的基因的擴增量，需屢次擴增才能檢測完不同的目的基因片斷的量。多通道利于做多重PCR，實現1次檢測多種目的基因的功能。
實時熒光定量PCR儀主要利用于臨床醫學檢測、生物醫藥研發、食品行業、科研院校等。
PCR儀常見問題及回答
1. cDNA產量的很低可能的緣由：*RNA模板質量低*對mRNA濃度估計太高*反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足*同位素磷32過期*反應體積過大，不應超過50μl2. 擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺*多見的緣由在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系*與反應起始時RNA的總量及純度有關*建議在實驗中加入對比RNA*第1鏈的反應產物在進行PCR擴增時，在總的反應體系中的含量不要超過1/10*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于第1鏈合成。由于RNA模板存在2級結構，如環狀結果，有可能致使GSP沒法與模板退火；或SSⅡ反轉錄酶沒法從此引物進行有效延伸。*目的mRNA中含有強的轉錄中斷位點，可以試用以下方法解決：a. 將第1鏈的反應溫度提高至50℃。b. 使用隨機6聚體代替Oligo(dT)進行第1鏈反應。3. 產生非特異性條帶*用RT陰性對比檢測是不是被基因組DNA污染。如果RT陰性對比的PCR結果也顯示一樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。*在PCR反應中，非特異的起始擴增將致使產生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，下降鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產生。*由于mRNA剪切方式的不同，根據選擇引物的不同將致使產生不同的RT-PCR結果。
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